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公元9年，王莽篡夺西汉的统治权，制订了一系列错误的民族政策，引起西域各国的反对，匈奴势力卷土重来。在匈奴主指使下，焉耆发兵杀西域都护但钦，举旗反汉。天凤三年（16年）派五威将王骏、西域都护李崇等谋图挽回颓势，并报但钦之仇。龟兹王丞德积极支持，与莎车王共同出兵7000余随军征计焉耆。王骏、李崇征讨叛汉之焉耆时，姑墨王丞与焉耆暗中勾结，于王骏中焉耆埋伏时，阵前倒戈，使王骏全军覆没。此事引起王莽震怒，改姑墨为“积善”，意为改恶从善。但姑墨王却利用混乱，“杀温宿王，并其国”。正当姑墨王杀气腾腾的时候，莎车王贤诈称都护，自称单于，不许邻国崛起，于是发兵攻姑墨。姑墨降，其属温宿也相应降莎车。莎车王贤继又灭子合、拘弥、于阗，称霸于塔里木盆地南沿诸国。莎车王贤先后将于阗、拘弥、姑墨、子合诸王杀之。公元46年冬，又杀龟兹王，立其子则罗为龟兹王，并在龟兹东境另立乌垒国，以驷鞬为乌垒王。莎车王贤对其他古国重征赋税，引起诸国的强烈反抗。“数岁，龟兹国人共杀则罗、驷鞬，而使匈奴，更请立王。匈奴立龟兹贵人身毒为龟兹王，龟兹由是属匈奴。”此后，龟兹王族由亲汉派变为亲匈派掌权，给东汉统一西域设置重重障碍。
  莎车在众国群起反抗下，迅速衰落。莎车王贤死于其婿于阗王广德之手。于阗王广德并莎车，降伏精绝等十余小国，尽占塔里木盆地南沿之绝大部分地区。龟兹依仗匈奴之势，从莎车手中夺取姑墨、温宿、乌垒，控制了塔里木盆地北缘沿通向西方的通道，形成了塔里木盆地龟兹、于阗争霸的新局面。
  残留西域的匈奴分裂势力得知于阗王兼并莎车后，立即纠集亲匈伙伴急攻于阗：“匈奴闻广德灭莎车，遣五将发焉耆、尉犁、龟兹十五国兵三万余人围于阗，广德乞降。”龟兹依仗匈奴势力，乘机扩张。汉明帝永平十六年（73年），龟兹王建攻杀疏勒王成，自以龟兹左侯兜题为疏勒王。至此，在匈奴的支持下，龟兹相继吞并姑墨、温宿，继又战败于阗，控制疏勒。
  就在龟兹王建攻取疏勒的同时，东汉朝已基本完成了中原的统一，着手北御匈奴，进取西域。东汉朝派军司马班超率吏士三十六人驰赴塔里木盆地南道。智勇双全、胆略超群的班超从鄯善、于阗、莎车一路过关斩将，驰赴疏勒。永平十七年（74年），班超以迅雷不及掩耳派人劫缚兜题，将其放归龟兹，另立疏勒王成之兄为疏勒王。永平十八年（75年），勾结匈奴的龟兹、焉耆王杀死西域都护陈睦。班超奉召回朝。龟兹王建闻讯，立即在疏勒以武力胁迫未降者。疏勒、于阗人民恳留班超，班超又重返疏勒，立即举兵打败龟兹王建的军队，并把它赶出了疏勒。建初三年（78年），班超又率疏勒、于阗、拘弥、康居一万人攻占了龟兹所属的姑墨石城。
  在匈奴的授意和支持下，龟兹贵族废黜了建，另立尤利多为龟兹王。尤利多登上龟兹王宝座后，竭尽全力为匈奴分裂势力和龟兹贵族效力，反攻班超，夺占姑墨，派人至莎车、疏勒策反，试图孤立班超。
  此时的班超，虽然兵单势孤，仍然镇定自若。在汉朝政府的少量援兵支持下，他运用智慧，首先发于阗诸国2.5万人进攻莎车。莎车王齐黎急向龟兹求救，尤利多派左将军檄调姑墨、温宿、尉头兵5万人往救。班超以少胜多攻灭莎车。尤利多兵败回守本土。尤利多在莎车、匈奴、车师相继降汉后，走投无路，遂于永元三年（91年）十二月率姑墨、温宿、尉头臣属降汉。班超随即立曾为汉廷侍子的白霸为龟兹王。《后汉书·班超传》载：“废其王尤利多而立白霸，使光（指司马姚光）将尤利多还诣京师。”东汉朝即任命班超为西域都护，徐干为长史，都护府由乌垒城迁到龟兹它乾城（今库车县牙哈乡）。
  西域都护府迁到西域经济、文化最发达而地理位置最适中的龟兹绿洲，为东汉朝治辖西域奠定了基石，西域此时号称的五十余国，悉皆纳质内属。