重庆图书馆

酸性染料對於細胞漿之親和力較大，而鹼性染料對於細胞核之親和力較大。至於細菌，雖無明確之核可尋，而核質瀰散於菌體內，則用於染細菌之染料，大多為鹼性阿尼林(Aniline)染料。
   屬於鹼性色素者，如；美藍(Methylene Blne)洋紅(Fuchsin)，俾斯麥褐(Bismark Brwon，Vesuvin)美紫(Methyl Violet)，結晶紫(Cr-ystalViolet)龍膽紫(GentianViolet)番紅花紅(Safranin)，維多利亞藍（Victoria Blue)孔雀綠（Malachite Green）等。屬於酸性者，如；伊紅(Eosin)酸洋紅(Acid Fuchsin胭脂紅(Carmin)等。
   染料之溶解性，各不相同，通常用於細菌染色之染料，在26℃下溶於水及酒精內成為飽和液所需之量，列表如下：
  
   ★龍膽紫係結晶紫，美紫及糊精（Detrin）三者之混合物。
   最常用之染料為洋紅，美藍，結晶紫及龍膽紫，可預先配成飽和酒精液，通稱曰原液，貯於玻璃有色瓶內。臨用時，用吸管吸取上部清液，或用濾紙濾過，不僅可免臨時配製之煩瑣，且不致抛棄未溶解之殘滓。
   第二項 標本製作法
   1．細菌布塗標本：
   細菌之染色標本，通常均用載物玻片，除特殊情形外，概取下述數步驟：
   (1)塗布於載物玻片，(2)空氣中乾燥，(3)固定，(4)染色，(5)水洗，(6)吸乾等。
   塗布——白金耳用火焰滅菌，俟稍冷，取生理食鹽水或蒸餾水一白金耳滴於載物片上，再將白金耳，滅菌冷却後，自固體培養基上採取被檢材料，混於水滴內，加以塗布以愈薄愈佳。白金耳於用後，火焰滅菌後放置之，所用之生理食鹽水或蒸餾水，宜少，一白金耳已足，並非一滴，少則塗布之範圍小，易於乾燥，且節省染料。所採取之細菌材料，亦不應過多，少則薄而勻，多則太厚，致染色不勻，尤以鑑別染色如革蘭氏染色或抗酸性染色為甚。初學者最易犯此，應加注意。按吾人之經驗，以白金耳之一側採取材料，將此有材料一側稍稍接觸於玻片上水滴，換以無材料側塗布之，則材料不致太多。設被檢物為液體，如膿汁，滲出物，肉浸液培養等，則不必先取水滴，即直接塗布液體材料於玻片上。細菌之液體培養，不易固定細菌於玻片，故不適於製塗布標本，否則，應在火焰上固定。如被檢物為臟器，則用滅菌鑷子撕裂一小塊，用其裂面塗布於玻片，設為難於塗布之材料，如粘靱之痰液，疣腫結節，細菌結實之集落時等,則可將其夾壓於兩玻片間，輕輕擠壓，使成均勻之薄層。
   乾燥——已塗布就之標本，應俟其在空氣中自然乾燥。必要時，可於火焰高處，以材料面向上，略烤使乾，可縮短時間。但切勿貪其速而靠近火焰。苟於此，則材料凝集，將不堪檢視。吾人常以右手持標本片在遠離火焰處烘烤，以左手在標本片下試深溫度，以覺微熱為度，不宜過燙。
   固定——已乾燥之標本，使塗布面向上，於火焰中通過三次，其速度不易形容，有謂如以刀切物之速皮，或如鐘擺擺動之速度，則頗恰當。經此固定手續後，菌體蛋白質凝固於玻璃面上，固定不易剝離，除用火焰熱固定法外，視標本性質之不同，有用化學藥品，如一烷醇蟻醛，飽和昇汞水溶液，Zueker氏液，或醋酸以固定者。若係用化學藥品固定，則於固定後應以水冲洗方可染色。
   染色——持固定之標本水平位置，或標本多時，將其排列架上，滴加染色液於其材料面上，以鋪滿材料面為準。視材料及色素之種類，染色時間長短不一。有時或更須加溫，以促進色素染於所欲檢視之材料。
   水洗——染色畢，立即傾去染液，以普通水冲洗，至冲下之水中不見有色素流下為度。
   吸乾一一水洗畢，將標本片經壓於二吸墨紙（或濾紙）間，充分吸乾，但不可摩擦，最好在空氣中任其自行乾燥。或於火焰上乾燥之，甚有不能用吸墨紙吸乾，而務必在火焰上乾燥者。 2．血液塗布標本：
   多用於檢驗血像，寄生蟲及螺旋體等，於細菌學檢驗工作，亦不可缺。此種技術較為艱難，往往不易得美滿之結果，非細心多事練習不可，其步驟如下：
   採血——採血之部位以耳垂下緣，或指端為宜，採血部先用70％酒精擦淨。然後取刺血針刺破皮膚，俟血滴自行流出，以潔淨之載物片之一端沾取血滴一滴，材料不宜過多，多則塗布太厚，不易檢視。
   塗布——以推移片之缺角端斜置於載物片之血滴前方，約成45°角，俟血液流及全片之端緣，即以平均之腕力與速度，向前推移，至血液完全塗布為止，未塗完前不可終止推移。塗布之血液層，以愈薄愈易透視。
   固定——俟標本於空氣中自行乾燥後，用純一烷醇(Methyl Alco-hol)滴於標本面上，經三五分鐘，材料即固定於片上，不易脫落。
   染色——主要為Wrght氏法與Giemsa氏法，詳後染色法項下。
   第三項 染色法
   1.普通染色法：
   最常用之簡單染色液，為呂弗琉氏鹼性美藍液及稀釋萋耳氏石碳酸洋紅。
   一、呂氏美藍液
   染色法：美藍酒精飽和液（約100c．c．95%酒精內加美藍2gm）30c.c．
   1：10000苛性鉀水溶液 100c．c．
   （此稀釋苛性鉀液，以1c．c．之1%苛性鉀加於99c．c．水內即成）
   此美藍液，陳舊者較新鮮者之染色成績更隹。
   染色法：1．標本法於空氣中乾燥後，以火焰固定之。
   2．滴加染色液於材料面上歷五分鐘。
   3.以水冲洗，吸乾，以付鏡檢。
   二、稀釋洋紅液
   染色液：鹽基性洋紅飽和酒精(約100c.c.之95％酒精內加洋〓Ogm)Oc.c． 5％石炭酸水溶液，(用蒸餾水配合)100c.c．
   （按上方配合，即成為萋耳氏石炭酸洋紅液，所謂稀釋洋紅液者，臨用時加蒸餾水作1；10稀釋即成）。
   染色法：1.標本於空氣中乾燥後，以火焰固定之。
   2．滴加染色液於材料面上歷時三分鐘。
   3．以水冲洗，吸乾，以付鏡檢。
   2．鑑別染色法：Gram氏染色法：
   在鑑別染色法中，以Gram氏染色法為最重要，因此種染色法，可以把細菌分為Gram氏陽性與Gram氏陰性兩大類，則於細菌鑑別診斷上，具有極大之價值。茲就Hucker氏改良革籣氏染色法，敍述於次：
   染色液：1．結晶紫溶液
   a．結晶紫飽和酒精液（結晶紫溶於20c．c．之95％酒精內）20c．c.
   b．1％草酸铔(Ammonium Oxate)水溶液80c．c．
   將a.b．二液配成後，將b液加入a液內，混合之即得。
   2．Lugol氏碘溶液
   碘 1gm．
   碘化鉀 2gm．
   蒸餾水 300c．c．
   3．純酒精（或95%酒精）
   4.複染液
   25%沙黃(Safranine)酒精溶液 10c．c.
   蒸餾水 100c．c．
   染色法：1．按常法固定標本。
   2．滴加結晶紫溶液於載物片上，染色30秒。
   3．水洗
   4．滴加Lugol氏溶液染色一分鐘。
   5．水洗
   6．用酒精脫色半分鐘至一分鐘。 7．水洗
   8．用沙黃稀釋液複染十秒鐘。
   9.水洗，吸乾以付鏡檢。
   此時陽性者呈深紫色，陰性者則呈複染之之紅色。至於Gram氏染色之原理，說者不一，而以Beniane氏之說較為合理。氏謂細菌之所以染成Gram氏陽或陰性者，乃由於各種細菌外膜穿透性不同所致。碘可以與結晶紫化合成一種不溶於水而溶解於酒精之化合物。至於Gram氏陽性細菌之細胞膜可以使結晶紫透入，再以碘染色，則碘與已透入細胞內之結晶紫化合，但Gram氏陽性細菌之細胞膜不能使碘結晶紫化合物之酒精溶液透出，則雖作用以酒精亦不致脫色。Gram氏陰性細菌膜則有兩種：一種如腦膜炎球菌之細胞膜，亦可使結晶紫透過，同時亦能使碘結晶紫化合物之酒精溶液透出，所以在酒精脫色時，紫色即被洗出細菌體，而着受複染之顏色；另一種Gram氏陰性細菌，其細胞膜根本不能使結晶紫透過，亦不能使碘結晶紫酒精溶液透過，在用結晶紫染色時，結晶紫僅能吸附於細菌體外表，實際上並未透細胞內，結晶紫與碘之化合物自亦在菌體表面，經酒精之溶解後，當難洗去。
   Gram氏染色之技術雖云簡單，然往往不易得美滿之結果。若能精確遵守時間，則不致有誤，尤以加Lugol氏液及酒精脫色之時間為最重要。吾人為謹慎起見，另用已知之Gram氏陽性細菌如葡萄狀球菌，作為對照，則可判斷染色之結果是否準確。
   按Gram氏染色法之原法，非用結晶紫溶液，而用阿尼林龍胆紫。後來改用石碳酸龍胆紫，係以一份之龍胆紫酒精飽和液以十份之5%石炭酸水溶液配合而成。惟結晶紫溶液染色之成績較龍胆紫為隹，今已取而代之。
   至於複染液，亦可用1：10之稀釋石碳酸洋紅液，或俾斯麥褐(Bi-smarck Browh)，其配合法，即將0．2gm之俾斯麥褐溶於100c．c．沸水中，俟冷濾過備用。
   重要Gram氏陽性菌，如葡萄狀球菌，鏈球菌，肺炎雙球菌，四聯球菌，白喉桿菌，破傷風桿菌，結核桿菌，痲瘋桿菌，炭疽桿菌，枯草桿菌等。 重要之革蘭氏陰性菌，如腦膜炎球菌，淋球菌，大腸菌，傷寒桿菌屬，痢菌屬，馬鼻疽桿菌，鼠疫桿菌，流行性感冒桿菌，百日咳桿菌，杜克來氏桿菌(H．ducrey)，布魯氏菌屬，霍亂孤菌等。
   三、結核桿菌及痲瘋桿菌染色法：
   （一）萋納二氏染色法Ziehl—Neelsen Stain 。
   染色液：1．萋耳氏石炭酸洋紅液
   2．3%鹽酸酒精(Hcl—alcohol)
   3．呂弗琉氏美藍液
   染色法：1.按常法固定標本。
   2．將標本片架於加溫台上，滴加萋耳氏石炭酸洋紅液。
   3．用酒精燈在加溫台下加溫，至有汽騰，即將燈移去，如此數囘，經5—10分鐘。但不可將染色煑沸而致乾燥，不特難於脫色，且標本有炸裂之虞，是宜注意。
   4．用鹽酸酒精脫色，至幾無紅色為度。
   5．水洗
   6．用呂弗琉氏美藍液複染半分鐘。
   7．水洗，吸乾後鏡檢。如此則結核桿菌與痳瘋桿菌着受紅色，其他細菌或細胞着受藍色。
   結核桿菌與痲瘋捍菌，不易着受鹽基性阿尼林色素，非增强濃度，加長時間或加熱不成功，然既經着受以後，即用强濃度鑛酸及酒精亦不易脫色，是以稱此等細菌為抗酸性及抗酒精性細菌。
   四、血液標本染色法：
   (一)Wright氏色法
   染色液：(Wrignt氏染料) 0．1gm．
   純甲醇(Metyhl Alcohol) 60c．c．
   先將Wright氏染料粉劑入乳缽中，加甲醇少許，加以研磨漸漸加足所需之甲醇量。臨用前過濾之，保存於暗處，嚴密封塞，避免潮濕。新鮮染色液呈鹼性，久置後，變為酸性。若反應不準，可以稀釋緩衝液以矯正之，有時將新舊兩種Wright氏液相混合亦可，或加以少量之冰醋酸或苛性鈉。
   染色法：1.將此液滴加十滴於玻片上經一分鐘。
   2．立即用附橡皮帽之吸管滴加蒸餾水十滴，經五分鐘(必要時得延長之，至染色液表面現有金屬浮渣為止)。
   3．用蒸鹽水冲洗。
   4．斜置之使水流下，俟乾，或細心吸乾之。
   所謂Wright氏染料，係將美籃1gm。加於0.5％之炭酸鈉100c．c．內，在阿魯氏滅菌器內加熱一小時。俟冷，濾過，加1：1000之黃色水溶性伊紅液500c．c．。加伊紅液時，應徐徐加入，時加搖動，至籃色消失為止，變成帶黃之紫色，表面現金屬浮渣，且形成黑色微細顆粒沉澱物。濾過，自濾紙上採集沉澱物，置37℃孵育箱內使完全乾燥即成。
   染色時，為避免標本表面有顆粒沉着起見，可將標本片以面向下置於錶玻面內，加未稀釋之染色液，使標本面滿布為止，經一分鐘，加等量之蒸餾水以稀釋之，經五分鐘，以鑷子取出標本片以水冲洗之。
   所用之蒸餾水應無二氧化炭，於臨用前加以煑沸，俟冷即可。如不能得蒸餾水，雨水可以替代。
   (二姬母薩(Giemsa氏染色法：
   染色液：第二號天青伊紅(Azur Eosin) 0.3gm.
   第二號天青(Azur) 00.8gm．
   純甘油( ClycerineC．P．) 26c.c．
   甲醇(Methyl Alcono) 25c.c.
   將第二號天青伊紅及第二號天青先溶於60℃之甘油內，後再於同樣溫度下加入甲醇內。放置一夜，濾過之·德國Gruebler公司有現成配就之液體出售，殊稱便利。
   染色法：1.染色時，應將上述原液加以稀釋，通常每c．c．蒸餾水加原液一滴，每張標本，約需稀釋染色液5c．c．即可滿布標本面，是以在操作前應加預算。有時，為加强染色計，用1：1000稀釋之炭酸鈉以代蒸餾水。
   2.血液塗布標本用甲醇固定1—5分鐘（厚滴標本無需固定）。
   3．乾燥後，將稀釋染色液滴加材料面上，或將材料面向下，浮於染色液上，經15—30分鐘。
   4．用蒸餾水冲洗，至標本呈粉紅色調為度。
   5．待乾燥後，或細心吸乾，加油，鏡檢。
   在染螺旋體或染三日瘧惡性瘧赤血球內粗大斑點時，乃用鹼性稀釋染色液。染梅毒螺旋體時，需2—12小時。
   水洗前，切不可將色素液先行傾出，宜直接以水冲洗，蓋色素液表層已形成金屬性薄膜，設將色素傾去，則薄膜將附着於玻片上，頗為檢視之障礙。
   染色後，細菌呈青色或紅色，赤血球呈淡紅色。